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中国医科大学学报 ›› 2017, Vol. 46 ›› Issue (10): 865-868.doi: 10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.001

• 论著 •    下一篇

Cav1.2钙通道C末端远端片段dDCT重组质粒的构建及蛋白制备

胡慧媛1,雷帅1,孙德日2,孙旋旋1,晏珊1,刘世浩1,王健1,王莹1,李越1,郝丽英1   

  1. 中国医科大学 1 药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122;2 附属第四医院骨科,沈阳 110032
  • 收稿日期:2017-03-28 出版日期:2017-10-30 发布日期:2017-10-16
  • 通讯作者: 郝丽英 E-mail:lyhao@cmu.edu.cn
  • 作者简介:胡慧媛(1978 -),女,副教授,博士
  • 基金资助:
    国家自然科学基金(81100108,31471091);医学电生理学 教育部重点实验室开放基金(201605);辽宁省大学生创 新创业训练项目(201410159018)

Construction of and Protein Preparation from a Recombinant Plasmid Containing the Distal Fragment of the Distal C-terminus of the Cav1.2 Channel

HU Huiyuan1,LEI Shuai1,SUN Deri2,SUN Xuanxuan1,YAN Shan1,LIU Shihao1,WANG Jian1,WANG Ying1,LI Yue1,HAO Liying1   

  1. 1 Department of Pharmaceutical Toxicology,School of Pharmacy,China Medical University,Shenyang 110122,China;2 Department of Orthopedics,The Fourth Affiliated Hospital,China Medical University,Shenyang 110032,China
  • Received:2017-03-28 Online:2017-10-30 Published:2017-10-16

摘要: 目的 构建Cav1.2钙通道C末端远端片段(dDCT)(2 080~2 169)质粒,表达、提取、纯化蛋白并进行生物学活性鉴定。方法 将dDCT的cDNA片段插入pGEX-6p-1质粒载体并转化大肠杆菌,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导蛋白表达,超声破碎法提 取蛋白。GS-4B beads纯化蛋白后,pull-down方法分析其生物学活性。结果 构建的dDCT质粒经限制性内切酶和测序双重鉴定 成功,经超声破碎法提取的dDCT蛋白纯度和浓度均较高,并具有能够与GST-CT1融合蛋白浓度依赖性结合的生物学活性。结论 本研究成功构建了dDCT重组质粒,为深入探讨Cav1.2钙通道的自身调节机制奠定了重要的物质基础。

关键词: Cav1.2钙通道, C末端远端片段, pull-down方法

Abstract: Objective To construct a recombinant plasmid vector containing the distal fragment of the distal C-terminus(dDCT)of the Cav1.2 channel,and express,extract,and purify dDCT protein and aracterize its biological activity. Methods dDCT cDNA was ligated into the pGEX-6p-1 vector to create a recombinant plasmid that was subsequently transformed into Escherichia coli BL21 competent cells. Expression of GST-dDCT fusion protein from this plasmid was induced with isopropy-β-D-thiogalactoside,and the resulting protein was purified using glutathione-sepharose 4B beads. The biological activity of dDCT was analyzed by GST pull-down assay. Results The re- combinant plasmid was verified by restriction enzyme digestion and sequencing. The concentration and purity of the dDCT protein,which was extracted by ultrasonication,were high enough to detect dDCT activity. The binding of dDCT to CT1 was determined to be concentra- tion-dependent. Conclusion The recombinant dDCT plasmid was successfully constructed,providing the fundamental basis for future studies on mechanisms of Cav1.2 channel autoregulation.

Key words: Cav1.2 Channel, distal fragment of the distal, C-terminus, pull-down assay

中图分类号: 

  • R96
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