中国医科大学学报

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中国医科大学学报 ›› 2016, Vol. 45 ›› Issue (5): 394–397.doi: 10.12007/j.issn.0258-4646.2016.05.003

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钙调蛋白镁结合位点突变体载体的构建、表达纯化及鉴定

赵美眯,李卓,邵冬雪,梁洪玥,晏珊,封瑞,孙雪菲,郭凤,郝丽英   

  1. 中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122
  • 收稿日期:2015-09-02 出版日期:2016-05-30 发布日期:2016-05-09
  • 通讯作者: 郝丽英 E-mail:lyhao@mail.cmu.edu.cn
  • 作者简介:赵美眯(1978 -),女,讲师,博士.
  • 基金资助:
    国家自然科学基金(31471091,31500930);医学电生理学 重点实验室开放基金(KeyME?2014?03)

Vector Construction,Protein Expression,Purification and Identification of Calmodulin Mg2+ Binding Site Mutants

ZHAO Meimi,LI Zhuo,SHAO Dongxue,LIANG Hongyue,YAN Shan,FENG Rui,SUN Xuefei,GUO Feng,HAO Liying   

  1. Department of Pharmaceutical Toxicology,School of Pharmacy,China Medical University,Shenyang 110122,China
  • Received:2015-09-02 Online:2016-05-30 Published:2016-05-09

摘要: 目的 构建钙调蛋白 3 种镁离子结合位点突变体的质粒载体,并进行表达纯化及鉴定,为深入研究钙调蛋白的生物学功能奠定基础。方法 利用钙调蛋白 cDNA 进行点突变,制备 3 种镁离子结合位点突变的 cDNA。将突变后的 cDNA 分别插入pGEX-6P-3 载体,制备钙调蛋白突变体载体质粒。质粒转化大肠杆菌 BL21 感受态细胞,培养大肠杆菌,并诱导 GST 融合蛋白表达。利用 Glutathione-Sepharose 4B 珠子和 PreScission 蛋白酶分离纯化蛋白。结果 酶切鉴定和 DNA 测序证实成功构建钙调蛋白突变体质粒;表达纯化得到的钙调蛋白突变体经电泳图鉴定纯度较高,浓度约 1.0 mg/mL。结论 本研究成功构建了钙调蛋白镁结合位点突变体融合蛋白原核表达质粒,分离纯化可获得较高浓度较高纯度的钙调蛋白突变体。

关键词: 钙调蛋白, 突变体, 融合蛋白, pGEX-6P-3

Abstract: Objective To construct plasmid vectors of calmodulin(CaM)Mg2+ binding site mutants,and to express,purify and identify the mutant proteins. Methods Three kinds of cDNAs coding for the mutated CaM were cloned into pGEX-6P-3 plasmid vectors. These recombinant plasmids were transfected into Escherichia coli BL21 to express GST fusion proteins of CaM mutants. The fusion proteins were purified with Glutathione-Sepharose 4B beads and PreScission protease. ResultsBoth enzyme digestion analysis and DNA sequence identification proved the successful construction of the CaM mutant plasmids. SDS-PAGE results showed the high purity of each CaM mutant protein. The concentrations of three CaM mutants were around 1.0 mg/mL. Conclusion Prokayotic expression vectors of CaM Mg2+ binding site mutants were successfully developed,and the eligible CaM mutant proteins were obtained. This study provided an important basis for further study on CaM’s biological function.

Key words: calmodulin, mutant, fusion protein, pGEX-6P-3

中图分类号: 

  • R96
[1] 苏敬阳, 王蓉蓉, 袁媛, 李松霖, 朱正南, 黄露婷, 封瑞, 邵冬雪, 孙雪菲, 郝丽英. CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定[J]. 中国医科大学学报, 2018, 47(2): 97-101.
[2] 李丹妮, 刘云鹏. GATA1不同激酶活性突变体质粒的构建及蛋白表达和亚细胞定位[J]. 中国医科大学学报, 2018, 47(1): 22-26.
[3] 徐硕妍 ,王千慧 ,郭凤. 钙离子/钙调蛋白激酶Ⅱ在癫痫中的作用机制[J]. 中国医科大学学报, 2017, 46(7): 577-581.
[4] 晏珊,雷帅,陈思充,于佳慧,祝旭东,孙嘉瑶,杜逸,李墨,唐子鉴,郝丽英. 钙调蛋白 N2 和 C2 突变体载体的构建、表达纯化和鉴定[J]. 中国医科大学学报, 2017, 46(5): 401-405.
[5] 邵冬雪,孙嘉瑶,杜逸,李墨,唐子鉴,于佳慧,胡慧媛,孙雪菲,孙胜男,郝丽英. 钙调蛋白的 N 末端和 C 末端片段载体构建和蛋白制备[J]. 中国医科大学学报, 2016, 45(10): 877-882.
[6] 雷明, 赵美眯, 封瑞, 王红梅, 毛楠, 朱彤, 郝丽英. Cav1.2通道CT1片断突变体的质粒构建和蛋白表达[J]. 中国医科大学学报, 2015, 44(9): 837-839.
[7] 封瑞,刘彦,杨磊,胡慧媛,郭凤,赵美眯,赵金生,郝丽英. 豚鼠钙调蛋白2基因编码区及3′端非编码区序列克隆[J]. 中国医科大学学报, 2015, 44(2): 123-126.
[8] 孙威,封瑞 ,郭凤,赵金生,赵美眯,高青华,王红梅,毛楠,郝丽英. PreIQ及其突变体载体构建表达纯化和活性鉴定[J]. 中国医科大学学报, 2014, 43(4): 293-296.
[9] 何文凯,李明琰,崔永生,陈建威,王月刚,陈冬冬,吴平生. 重组腺病毒低氧诱导因子1α三突变体基因对兔缺血后肢血流灌注及血管渗透性的影响[J]. 中国医科大学学报, 2014, 43(3): 240-242.
[10] 何桂林,邵冬雪,印丹丹,胡慧媛,郭凤,王红梅,郝丽英. 体外重组CaV1.2不同蛋白片度纯化及其与CaM相互作用的研究[J]. 中国医科大学学报, 2013, 42(9): 773-776.
[11] 邵阳光,刘姣,李丰,. GST-HDAC4融合蛋白载体的构建及其蛋白表达[J]. 中国医科大学学报, 2013, 42(2): 149-151.
[12] 封瑞,胡慧媛,郭凤,于丽凤,赵美眯,龟山正树,郝丽英. Cav1.2钙通道片段CT1融合蛋白的制备及生物学活性鉴定[J]. 中国医科大学学报, 2013, 42(11): 970-973.
[13] 王利利,刘彩红,朱亚勤. 高GC hTwist表达载体构建及其表达条件优化[J]. 中国医科大学学报, 2012, 41(3): 204-208.
[14] 赵金生,赵妍,赵美眯,刘书源,侯平,郝丽英. 部分纯化的牛心细胞质提取物对心肌细胞膜#x0201c;run-down#x0201d;L-型钙通道活性的恢复作用[J]. 中国医科大学学报, 2012, 41(12): 1060-1064.
[15] 张红艳, 李彦姝, 王春玉, 苏楠, 李丹妮, 李丰. hPAK4基因重组质粒的构建及蛋白表达[J]. 中国医科大学学报, 2010, 39(2): 84-.
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