中国医科大学学报

中国医科大学学报

中国医科大学学报 ›› 2016, Vol. 45 ›› Issue (10): 877–882.doi: 10.12007/j.issn.0258-4646.2016.10.003

• 论著 • 上一篇    下一篇

钙调蛋白的 N 末端和 C 末端片段载体构建和蛋白制备

邵冬雪,孙嘉瑶,杜逸,李墨,唐子鉴,于佳慧,胡慧媛,孙雪菲,孙胜男,郝丽英   

  1. 中国医科大学药学院药物毒理教研室,沈阳 110122
  • 收稿日期:2016-01-19 出版日期:2016-10-30 发布日期:2016-10-11
  • 通讯作者: 郝丽英 E-mail:lyhao@mail.cmu.edu.cn
  • 作者简介:邵冬雪(1987 -),女,讲师,博士 .
  • 基金资助:
    国 家 自 然 科 学 基 金(31471091);大 学 生 创 新 训 练 项 目(2015023,201610159000052,201610159000107)

Vector Construction and Protein Preparation of N- and C-terminal Lobe of Calmodulin

SHAO Dongxue,SUN Jiayao,DU Yi,LI Mo,TANG Zijian,YU Jiahui,HU Huiyuan,SUN Xuefei,SUN Shengnan,HAO Liying   

  1. Department of Pharmaceutical Toxicology,Pharmacy College,China Medical University,Shenyang 110122,China
  • Received:2016-01-19 Online:2016-10-30 Published:2016-10-11

摘要: 目的 构建钙调蛋白(CaM)的 N 末端片段(N-lobe)、C 末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe,C-lobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定。方法 将上述 cDNA 片段插入 PGEX-6p-3 质粒载体后转化大肠杆菌 BL21 感受态细胞,异丙基硫代-β-D 半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。利用 Glutathione-Sepharose 4B beads 进行分离纯化。采用 SDS-PAGE 检测目的 蛋白纯度和相对分子质量,Bradford 方法 测定纯化后蛋白浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化 后蛋白活性。结果 蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度目的 蛋白,纯化后蛋白能与 Cav1.2 型钙通道结合并可恢复已“run- down”心肌细胞膜钙通道的活性。结论 本研究成功构建可以表达生物活性蛋白的 N-lobe、C-lobe、N-lobe12 及 C-lobe34 原核表达 载体,为深入研究 CaM 的生物学功能奠定了基础。

关键词: 钙调蛋白, N 末端片段, C 末端片段, 突变体, pull-down, 膜片钳

Abstract: Objective To establish prokaryotic expression vectors for the expression,purification and activity identification of N-terminal lobe(N-lobe),C-terminal lobe(C-lobe)of calmodulin(CaM)and their Ca2+-insensitive mutants(N-lobe,C-lobe )GST fusion protein. Methods cDNAs of N-lobe,C-lobe and their mutants were individually ligated into pGEX- 6p-3 plasmid vector,and then transformed into Escherichia coli BL21 component cells. The bacteria were incubated,and induced with IPTG before harvesting. The corresponding peptides were expressed as glutathione-S-transferase(GST)fusion proteins and purified using Glutathione Sepharose 4B beads. The GST regions of N-lobe,C-lobe and their corresponding mutants were cleaved with PreScission Protease. SDS-PAGE was used to detect the purity and relative molecular weight. Bradford method was used to determine the concentration. The protein activity was determined by pull-down assay and patch-clamp technique. Results SDS-PAGE confirmed the recombinant lobes of CaM with high purity,and high concentrations of CaM had been successfully purified. Individual N-lobe,C-lobe and their mutants could bind to N-terminal tails of Cav1.2(NT)and rescue the channel activity from run-down in ventricular myocytes of guinea-pig heart. Conclusion The prokaryotic expression vectors for the expressions of N-lobe,C-lobe and their mutants have been successfully established,which provides the basis for further researches on biological functions of CaM.

Key words: calmodulin, N-lobe, C-lobe, mutants, pull-down, patch-clamp

中图分类号: 

  • R96
[1] 苏敬阳, 王蓉蓉, 袁媛, 李松霖, 朱正南, 黄露婷, 封瑞, 邵冬雪, 孙雪菲, 郝丽英. CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定[J]. 中国医科大学学报, 2018, 47(2): 97-101.
[2] 徐硕妍 ,王千慧 ,郭凤. 钙离子/钙调蛋白激酶Ⅱ在癫痫中的作用机制[J]. 中国医科大学学报, 2017, 46(7): 577-581.
[3] 苏敬阳,邵冬雪,雷明,康泽,赵君,方涵田,郭凤,赵美眯,郝丽英,封瑞. 心肌 Cav1.2 钙通道 NT 片段的提取纯化及其与 CaM 的相互作用[J]. 中国医科大学学报, 2017, 46(5): 397-400.
[4] 晏珊,雷帅,陈思充,于佳慧,祝旭东,孙嘉瑶,杜逸,李墨,唐子鉴,郝丽英. 钙调蛋白 N2 和 C2 突变体载体的构建、表达纯化和鉴定[J]. 中国医科大学学报, 2017, 46(5): 401-405.
[5] 胡慧媛,雷帅,孙德日,孙旋旋,晏珊,刘世浩,王健,王莹,李越,郝丽英. Cav1.2钙通道C末端远端片段dDCT重组质粒的构建及蛋白制备[J]. 中国医科大学学报, 2017, 46(10): 865-868.
[6] 赵美眯,李卓,邵冬雪,梁洪玥,晏珊,封瑞,孙雪菲,郭凤,郝丽英. 钙调蛋白镁结合位点突变体载体的构建、表达纯化及鉴定[J]. 中国医科大学学报, 2016, 45(5): 394-397.
[7] 雷明, 赵美眯, 封瑞, 王红梅, 毛楠, 朱彤, 郝丽英. Cav1.2通道CT1片断突变体的质粒构建和蛋白表达[J]. 中国医科大学学报, 2015, 44(9): 837-839.
[8] 封瑞,刘彦,杨磊,胡慧媛,郭凤,赵美眯,赵金生,郝丽英. 豚鼠钙调蛋白2基因编码区及3′端非编码区序列克隆[J]. 中国医科大学学报, 2015, 44(2): 123-126.
[9] 孙威,封瑞 ,郭凤,赵金生,赵美眯,高青华,王红梅,毛楠,郝丽英. PreIQ及其突变体载体构建表达纯化和活性鉴定[J]. 中国医科大学学报, 2014, 43(4): 293-296.
[10] 何文凯,李明琰,崔永生,陈建威,王月刚,陈冬冬,吴平生. 重组腺病毒低氧诱导因子1α三突变体基因对兔缺血后肢血流灌注及血管渗透性的影响[J]. 中国医科大学学报, 2014, 43(3): 240-242.
[11] 何桂林,邵冬雪,印丹丹,胡慧媛,郭凤,王红梅,郝丽英. 体外重组CaV1.2不同蛋白片度纯化及其与CaM相互作用的研究[J]. 中国医科大学学报, 2013, 42(9): 773-776.
[12] 姚阳,刘坤,杨宇,吴敏范,张丽艳,梁宇. 银杏内酯B对体外培养神经细胞延迟整流钾电流的作用[J]. 中国医科大学学报, 2013, 42(11): 982-984.
[13] 彭芳,陆永利,杨红卫. 尾核神经元的原代培养及离子通道特性的研究[J]. 中国医科大学学报, 2012, 41(8): 676-678.
[14] 郭凤,姚阳,孙威,孙雪菲,宫建,郝丽英 . 无镁诱导培养大鼠海马神经元与SH-SY5Y细胞自发性放电的变化 [J]. 中国医科大学学报, 2012, 41(7): 577-584.
[15] 赵金生,赵妍,赵美眯,刘书源,侯平,郝丽英. 部分纯化的牛心细胞质提取物对心肌细胞膜#x0201c;run-down#x0201d;L-型钙通道活性的恢复作用[J]. 中国医科大学学报, 2012, 41(12): 1060-1064.
Viewed
Full text


Abstract

Cited

  Shared   
  Discussed   
No Suggested Reading articles found!

中国医科大学学报版权所有©2018

未经允许,严禁擅自转载本站图文资料

地址:中国 沈阳市沈北新区蒲河路77号 110122

辽ICP备05014850

JOURNAL OF CHINA MEDICAL UNIVERSITY

ADDRESS: NO.77 PUHE ROAD

SHENYANG NORTH NEW AREA, SHENYANG

LIAONING PROVINCE, P.R. CHINA