中国医科大学学报

中国医科大学学报
  • 中文核心期刊
  • 中国科技核心期刊
  • 中国高校百佳科技期刊
  • BA、CA收录

中国医科大学学报 ›› 2017, Vol. 46 ›› Issue (5): 401-405.doi: 10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.005

• 论著 • 上一篇    下一篇

钙调蛋白 N2 和 C2 突变体载体的构建、表达纯化和鉴定

晏珊,雷帅,陈思充,于佳慧,祝旭东,孙嘉瑶,杜逸,李墨,唐子鉴,郝丽英   

  1. 中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122
  • 收稿日期:2016-09-14 出版日期:2017-05-30 发布日期:2017-05-18
  • 通讯作者: 郝丽英 E-mail:lyhao@mail.cmu.edu.cn
  • 作者简介:晏珊(1990 -),女,硕士研究生 .
  • 基金资助:
    国家自然科学基金(31471091);大学生创新计划项目(201610159052,201510159047,2015048,2015023)

Vector Construction,Protein Expression,Purification,and Identification of Calmodulin Mutants N2 and C2

YAN Shan,LEI Shuai,CHEN Sichong,YU Jiahui,ZHU Xudong,SUN Jiayao,DU Yi,LI Mo,TANG Zijian,HAO Liying   

  1. Department of Pharmaceutical Toxicology,School of Pharmacy,China Medical University,Shenyang 110122,China
  • Received:2016-09-14 Online:2017-05-30 Published:2017-05-18

摘要: 目的 构建钙调蛋白(CaM)N2 和 C2 突变体的表达性载体,表达纯化并进行活性鉴定,为进一步研究 CaM 与钙通道片段的相互作用奠定基础。 方法 将 CaM 的 N-lobe 和 C-lobe 的 cDNA 分别与相应的 N-lobe 和 C-lobe 的 cDNA 相连,制备 N2 和 C2 突变 体的 cDNA。将 N2 和 C2 的 cDNA 分别插入 pGEX-6p-3 载体,并将重组质粒转入 E.coli BL21 菌株,IPTG 诱导转化成功的菌株表达GST 融合蛋白,超声破碎法提取,GS-4B beads 纯化,SDS-PAGE 电泳鉴定目的蛋白相对分子质量及纯度,pull-down 实验鉴定活性。 结果 酶切鉴定以及 DNA 测序结果证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE 电泳图显示突变体蛋白纯度和浓度均较高;pull-down 实验结果证明突变体蛋白有生理活性,能与钙通道片段结合。 结论 本研究成功构建了 N2 和 C2 表达质粒,并提取、纯化 了有活性的钙调蛋白 N2 和 C2 突变体。

关键词: 钙调蛋白, N-lobe, C-lobe, N2, C2, pull-down 实验

Abstract: Objective To construct expression vectors of calmodulin(CaM)mutants N2 and C2,and to express,purify,and identify the mutant proteins,in order to study the interactions between CaM and calcium channels. Methods The cDNA of N-lobe and C-lobe of CaM were used to prepare the cDNA of N2 and C2. Next,the recombinant cDNAs were cloned into a pGEX-6p-3 plasmid,and the recombinant plasmids were transferred into E.coli BL21 cells. The transfected BL21 cells were stimulated with IPTG. The fusion proteins were extracted by ultrasonication and purified by using GS-4B beads. Finally,protein activity was identified by the pull - down assay. Results Both the restriction digestion map and the DNA sequence identification results confirmed that the recombinant plasmids were successfully constructed. SDS-PAGE results showed high purity and concentration of N2 and C2 proteins. Their activities and binding abilities with the calcium channel fragment were confirmed by the pull-down assay. Conclusion In this study,expression vectors of N2 and C2 are successfully constructed,and physiologically active N2 and C2 CaM mutant proteins are obtained.

Key words: calmodulin, N-lobe, C-lobe, N2, C2, pull-down assay

中图分类号: 

  • R96
[1] 苏敬阳, 王蓉蓉, 袁媛, 李松霖, 朱正南, 黄露婷, 封瑞, 邵冬雪, 孙雪菲, 郝丽英. CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定[J]. 中国医科大学学报, 2018, 47(2): 97-101.
[2] 徐硕妍 ,王千慧 ,郭凤. 钙离子/钙调蛋白激酶Ⅱ在癫痫中的作用机制[J]. 中国医科大学学报, 2017, 46(7): 577-581.
[3] 苏敬阳,邵冬雪,雷明,康泽,赵君,方涵田,郭凤,赵美眯,郝丽英,封瑞. 心肌 Cav1.2 钙通道 NT 片段的提取纯化及其与 CaM 的相互作用[J]. 中国医科大学学报, 2017, 46(5): 397-400.
[4] 赵美眯,李卓,邵冬雪,梁洪玥,晏珊,封瑞,孙雪菲,郭凤,郝丽英. 钙调蛋白镁结合位点突变体载体的构建、表达纯化及鉴定[J]. 中国医科大学学报, 2016, 45(5): 394-397.
[5] 关阳阳,肖明扬,潘亮,薛萍,张国培,逯晓波. 应用转染细胞研究 ERCC2/XPD 基因多态与短波紫外线 所致 DNA 损伤修复的关联[J]. 中国医科大学学报, 2016, 45(12): 1066-1071.
[6] 邵冬雪,孙嘉瑶,杜逸,李墨,唐子鉴,于佳慧,胡慧媛,孙雪菲,孙胜男,郝丽英. 钙调蛋白的 N 末端和 C 末端片段载体构建和蛋白制备[J]. 中国医科大学学报, 2016, 45(10): 877-882.
[7] 王芹,王彦,杜利清,徐畅,樊飞跃,刘强. XRCC2基因沉默联合辐射对结肠癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响[J]. 中国医科大学学报, 2015, 44(5): 385-388.
[8] 高青华,,刘水策,郭凤,刘书源,于向沉,夏尔巴提吾马尔,孙雪菲,毛楠,赵美眯,朱彤,郝丽英. 壬基苯酚对H9c2心肌细胞钙信号和细胞增殖的影响及其作用机制[J]. 中国医科大学学报, 2015, 44(2): 109-113.
[9] 封瑞,刘彦,杨磊,胡慧媛,郭凤,赵美眯,赵金生,郝丽英. 豚鼠钙调蛋白2基因编码区及3′端非编码区序列克隆[J]. 中国医科大学学报, 2015, 44(2): 123-126.
[10] 王红岩,刘峥嵘,赵晓丹,谢锋. DBC2在胃癌中的甲基化[J]. 中国医科大学学报, 2015, 44(2): 132-135.
[11] 胡军,赵渊源,孙靖涵,侯志文,于波. 胡黄连苷Ⅱ对乙醇诱导的H9C2心肌细胞损伤的保护作用[J]. 中国医科大学学报, 2014, 43(6): 523-526.
[12] 刘玲,刘新伟,梁灿鑫,何东伟,俞莹,王萍. 白藜芦醇对脂多糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的影响[J]. 中国医科大学学报, 2013, 42(4): 339-343.
[13] 赵金生,赵妍,赵美眯,刘书源,侯平,郝丽英. 部分纯化的牛心细胞质提取物对心肌细胞膜#x0201c;run-down#x0201d;L-型钙通道活性的恢复作用[J]. 中国医科大学学报, 2012, 41(12): 1060-1064.
[14] 侯怡, 魏薇, 董静, 王毅, 陈杰. 碘缺乏和甲状腺功能减退对大鼠仔鼠内嗅皮质钙调蛋白表达的影响[J]. 中国医科大学学报, 2009, 38(11): 804-.
Viewed
Full text


Abstract

Cited

  Shared   
  Discussed   
No Suggested Reading articles found!

中国医科大学学报版权所有©2018

未经允许,严禁擅自转载本站图文资料

地址:中国 沈阳市沈北新区蒲河路77号 110122

辽ICP备05014850

JOURNAL OF CHINA MEDICAL UNIVERSITY

ADDRESS: NO.77 PUHE ROAD

SHENYANG NORTH NEW AREA, SHENYANG

LIAONING PROVINCE, P.R. CHINA