中国医科大学学报

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中国医科大学学报 ›› 2010, Vol. 39 ›› Issue (2): 84–.

• 基础医学 •    下一篇

hPAK4基因重组质粒的构建及蛋白表达

张红艳; 李彦姝; 王春玉; 苏楠; 李丹妮; 李丰   

  1. 中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室细胞生物学卫生部重点实验室; 中国医科大学第94期临床医学系
  • 出版日期:2010-02-27 发布日期:2013-06-07
  • 通讯作者: 李丰 E-mail:fli@mail.cmu.edu.cn

Construction and the Recombinant Protein Expression of Human PAK4 Gene Fusion Plasmid

  • Online:2010-02-27 Published:2013-06-07

摘要:

目的构建hPAK4真核表达载体,证实融合蛋白在细胞内表达,融合蛋白可以用于GST-pulldown实验。方法提取人乳腺癌细胞MCF-7mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有GST标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293中,提取细胞蛋白进行Western
      blot检测,同时进行GST-pulldown实验。结果hPAK4全长基因序列克隆到真核表达载体pEBG中,酶切鉴定片段为1800bp。Westernblot检测到融合蛋白GST-hPAK4的表达,分子量约为94kDa,融合蛋白能够被Glutathione
      Sepharose4B沉淀。结论成功构建了hPAK4全长基因真核表达载体,同时鉴定了GST-hPAK4融合蛋白的表达,并且能够被Glutathione
      Sepharose4B沉淀。

关键词: PAK4基因, 蛋白质印迹, 融合蛋白, hPAK4, Western blot, 融合蛋白

Abstract:

Objective To construct the expression plasmid of human PAK4 gene
      and identify its recombinant protein expression.Methods Total RNA was
      extracted from human breast cancer MCF-7 cells.The hPAK4 coding sequence
      was amplified by polymerase chain reaction(PCR)method and subcloned into
      pEBG vector.After the target region was sequenced,the plasmid was
      transfected into HEK293 cell line.The expression of the recombinant
      plasmid in HEK293 cells was proved by Western blot.Results hPAK4 had been
      constructed into the expressing vector pEBG successfully.The length of the
      fragment was 1 800 bp,identified by restriction enzymes digestion.The
      expression of pEBG-hPAK4 fusion protein was detected by Western blot,with
      a molecular weight 94 KDa and was pulled down by Glutathione Sepharose
      4B.Conclusion The recombinant plasmid was successfully cloned into
      eukaryotic expressing vector,and the expression of pEBG-hPAK4 fusion
      protein was identified and pulled down by Glutathione Sepharose 4B.

Key words: PAK4 gene, Western blot, fusion protein, hPAK4, Western blot, fusion protein

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